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国自然热点怎么写?一篇8分文章教你circRNA课题设计思路

无花果 科研讲坛 2021-02-21
转眼又是一年暑假,今年的国自然评审结果即将公布。如果今年已中标无望,你是否已经开始筹备2021年的国自然申请了呢?是否还在为挑选什么样的研究热点而苦恼?要想课题难度适中,又有完整的机制研究,这里向你推荐国自然申请中的一大热点——circRNA。
环状RNA(circRNA)是近年来疾病研究中的热点,尤其在国自然基金申请中,circRNA相关研究的获批项目三年内呈持续增长。据统计,2016年circRNA相关的获批项目仅63项,2018年已增长到258项,2019年也有257项获批,其中增长最快的要属面上项目和青年项目。仔细浏览这些项目不难发现,circRNA通过调控基因表达进而调控信号通路,影响疾病发生的分子机制研究已成为课题设计的主流方向。

近几年国自然获批项目统计

如果你也想追踪这一热点,却无从下手的话,这里通过2019年发表于《EMBO MolecularMedicine》(IF:8.821),题为“Therapeutic targeting of circ-CUX1/EWSR1/MAZ axis inhibits glycolysis andneuroblastoma progression”的circRNA相关肿瘤研究,为你解析这一类国自然课题设计的思路。

 
一、立项依据
神经母细胞瘤(NB)是一种产生于原始神经嵴的恶性肿瘤,多发于婴幼儿。恶性程度高,占儿童癌症死亡率的15%。尽管现有多种模式的治疗手段,高危组神经母细胞瘤患者的预后依然不理想。
肿瘤细胞为了维持其肿瘤发生和侵袭能力,即使在氧充足的情况下,也会将大量的葡萄糖转化为乳酸,也就是有氧糖酵解过程(也叫做瓦博格效应),是肿瘤进程的重要标志。已知激活c-Myc或抑制p53基因表达会引起有氧糖酵解代谢和糖转运蛋白的异常表达,但是在神经母细胞瘤中有氧糖酵解的上游调控转录因子仍然未知。
环状RNA(circRNA)是近年来新发现的一类环状非编码RNA,不易被RNA酶降解,结构稳定。研究表明,circRNA可以吸附miRNA,发挥“小RNA海绵”的功能,调控下游基因表达;也可以结合目标蛋白,调节RNA转录和剪接过程。然而,肿瘤发展过程中,circRNA在有氧糖酵解中的作用尚不明确。
为了寻找神经母细胞瘤发展过程中对有氧糖酵解起重要作用的调控基因及circRNA,作者进行了以下预实验:
(1)通过基因芯片分析找到在糖酵解通路中差异表达的转录因子
作者首先选择了已有报道的神经母细胞瘤基因芯片数据(含88例病例),在已发现的与肿瘤发生发展密切关联的8个有氧糖酵解差异表达基因基础上,使用Genomatix软件进行再分析,找到了这些基因上游的52个转录因子。其中,CUX1排名最高。转录水平检测后发现CUX1确实在神经母细胞瘤细胞系中高表达。已有研究表明,CUX1调控肿瘤增殖迁移和EMT,其高表达与肿瘤患者预后差相关。

Genomatix软件下载页面

(http://www.genomatix.de/solutions/genomatix-software-suite.html)


(2)circ-CUX1与CUX1的表达和肿瘤发生高度相关
由于CUX1的基因拷贝数和遗传变异都与肿瘤细胞死亡、发展无显著相关性,因此推测CUX1上游受到非编码RNA的调控。利用 circBase分析获得37个可能调控CUX1的circRNA。进一步验证筛选7个神经母细胞瘤中表达的circRNA,并选出3个在NB细胞和正常细胞中差异表达的circRNA进行敲减。最终发现只有敲减circ-CUX1能降低CUX1的表达。


在多种肿瘤细胞中均检测到circ-CUX1的表达,肿瘤组织中的circ-CUX1异常高表达,且与CUX1的转录水平正相关。 


(3)RNA结合蛋白EWSR1与MAZ的筛选和确定
为了寻找circ-CUX1直接作用的蛋白,作者使用RNA-pulldown联合MS分析,利用RBPDB(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca)数据库和BioGRID(https://thebiogrid.org/)数据库,筛选出与circ-CUX1、CUX1可能互作的RNA结合蛋白EWSR1,ELAVL1和SYNCRIP。使用circ-CUX1探针进行RNA pull-down实验,将蛋白锁定为EWSR1。又利用RNAseq检测差异表达基因,以及ChIP-X程序预测与CUX1启动子结合的转录因子,以及与EWSR1可能互作的蛋白,最终确定转录激活因子MAZ。而在临床样本中,EWSR1和MAZ均与神经母细胞瘤预后差正相关。


基于以上数据,本文提出这样的假说:circ-CUX1通过与EWSR1结合,促进其与转录激活因子MAZ的结合,从而正调控CUX1转录水平,增强有氧糖酵解通路基因的表达,最终促进肿瘤的发生发展。
同时,通过设计一段治疗性小肽干扰circ-CUX1与EWSR1的结合,能有效抑制下游有氧糖酵解通路的基因表达,从而抑制神经母细胞瘤的发展。假说图如下:


二、研究内容
1、体外细胞实验验证:CUX1作为转录因子促进有氧糖酵解通路
1)在肿瘤细胞IMR32和SH-SY5Y中过表达和敲减CUX1,或者用组织蛋白酶L抑制剂E64D处理细胞,RT-qPCR和荧光素酶报告基因检测下游糖酵解通路基因ALDOA、ENO1、GAPDH、GPI、HK2、LDHA、PGK1、PKM表达。(过表达时ENO1、GPI、PGK1表达上调,敲减时表达下调。)


(2)在肿瘤细胞IMR32和SH-SY5Y中过表达和敲减CUX1,或者用组织蛋白酶L抑制剂E64D处理细胞,检测有氧糖酵解指标ECAR(细胞外酸化)和OCR(氧消耗);海马代谢曲线检测仪动态检测细胞ECAR。(敲减和E64D处理均能减弱有氧糖酵解。)


2、体外细胞实验验证:circ-CUX1正调控CUX1表达以及有氧糖酵解过程
(1)在四种不同的肿瘤细胞系中过表达(野生型和突变体)和敲减circ-CUX1,RT-qPCR、荧光素酶报告基因检测CUX1转录活性变化。(过表达和敲减分别提高和降低p200 CUX1转录水平,但不改变mRNA稳定性。)


(2)在四种不同的肿瘤细胞系中过表达(野生型和突变体)和敲减circ-CUX1,并检测有氧糖酵解指标ECAR、OCR。(过表达和敲减分别增强和减弱细胞有氧糖酵解。) 


3、功能验证:circ-CUX1通过促进有氧糖酵解增强神经母细胞瘤发生
(1)体外:在肿瘤细胞IMR32和SH-SY5Y中过表达和敲减circ-CUX1,检测细胞增殖和侵袭。(过表达和敲减分别促进和抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。)


(2)在裸鼠皮下种植上述操作的IMR32细胞,检测肿瘤的体积、质量,免疫组化检测增殖标志物Ki67,检测有氧糖酵解代谢产物(葡萄糖、乳酸、ATP)含量。无胸腺裸鼠静脉注射上述细胞,观察肺部肿瘤大小、转移和小鼠生存率。(过表达和敲减分别促进和抑制神经母细胞瘤的增殖和侵袭转移。)


4、分子实验验证:circ-CUX1/EWSR1/MAZ互作机制及其对有氧糖酵解通路的影响
(1)RNA-pull down、RNA-FISH、EMSA验证circ-CUX1和EWSR1直接结合。将EWSR1关键氨基酸位点(2个)突变,体外RNA-protein结合实验验证circ-CUX1与EWSR1结合位点。(circ-CUX1与EWSR1在394–397和406–410氨基酸位点结合。)


(2)coIP、BiFC实验验证EWSR1与MAZ直接结合。当敲减circ-CUX1时,EWSR1和MAZ的结合显著降低。


5、功能回复实验验证:circ-CUX1、EWSR1和WAZ三者结合促进CUX1表达和有氧糖酵解过程
在分别和同时过表达circ-CUX1、敲除EWSR1的IMR32细胞中分别用ChIP检测MAZ对下游靶基因的结合;在IMR32细胞中过表达circ-CUX1、敲减EWSR1或敲减MAZ后,在MAZ野生型和突变体细胞中用荧光素酶报告基因检测CUX1的启动子激活情况;RT-qPCR和WB检测下游靶基因的表达量。(circ-CUX1、EWSR1、MAZ三者结合才能促进下游有氧糖酵解基因的转录激活;突变MAZ激活位点后,转录激活作用消失。)


6、体外细胞实验及动物模型验证:小分子肽EIP22抑制神经母细胞瘤发生发展的机制
(1)体外细胞实验验证EIP22抑制肿瘤细胞增殖和侵袭
根据EWSR1与circ-CUX1结合的氨基酸位点设计EIP-22序列(竞争性结合),转入肿瘤细胞后荧光染色确定EIP-22定位,再观察细胞的增殖和侵袭情况,ChIP检测circ-CUX1与EWSR1的结合。(EIP-22阻碍EWSR1与circ-CUX1结合,体外抑制肿瘤增殖和侵袭。)


(2)动物实验验证EIP-22抑制肿瘤增殖和转移
裸鼠皮下注射肿瘤细胞成瘤后,静脉注射EIP-22,检测中路体积、质量,免疫组化检测增殖标志物Ki67;检测肿瘤转移和小鼠生存率。(EIP-22在体内抑制肿瘤生长和转移。)

   
技术路线


三、研究目标
1、阐明转录因子CUX1调控的有氧糖酵解对肿瘤发生发展和预后的影响;
2、阐明circ-CUX1调控转录因子CUX1促进有氧糖酵解基因表达的具体分子机制;
3、证明靶向circRNA的治疗性小分子肽抑制神经母细胞瘤发生发展的可行性和有效性。

四、特色与创新之处
1、本文展开的肿瘤细胞中有氧糖酵解通路转录水平调控机制的研究较少,尚未见报道;
2、circ-RNA介导的circCUX1/EWSR1/MAZ/CUX1反馈调控通路研究利用多组学和数据库联用的方法,从肿瘤中的有氧糖酵解异常活跃这一点出发,全面阐述导致这一现象的转录层面调控机制,并揭示了神经母细胞瘤预后差的可能原因;
3、基于分子机制的治疗靶点设计巧妙,在不改变RNA和蛋白水平的情况下特异性阻断circ-CUX1与蛋白的EWSR1的结合,从而有效干预有氧糖酵解过程,是一种新型的肿瘤治疗策略。

五、总结
本文阐述了一个circRNA介导的正反馈通路调控机制,证明了circ-CUX1、RNA结合蛋白EWSR1、转录激活因子MAZ三者结合,在神经母细胞瘤中促进CUX1转录因子基因自身的表达,从而促进有氧糖酵解通路下游代谢基因的表达。文章逻辑清晰,前期预实验运用大量的组学数据,后期又设计可用于临床的小分子肽抑制剂,从临床出发到分子机制,最后回到临床,具有较强的整体性。
不足之处在于本文的体内验证实验部分均未设计功能回复实验,使实验验证的完整度有所缺失。本文涉及的调控因素有三个(circCUX1,EWSR1,MAZ),若要完整地在体内外实验中阐明因果关系工作量十分巨大,还需要广大读者在做国自然课题设计时根据自身情况酌情考虑。

注:此推文未经许可禁止转载!

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